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Aspectos médicos: Genética/Inmunología

Servicio de Inmunología del Hospital Donostia


Hemofilia A

La Hemofilia A o deficiencia del Factor VIII (Fc VIII) de la coagulación es una de las principales coagulopatías en humanos, y afecta aproximadamente 1 de cada 10000 varones. La herencia de este trastorno es recesiva y va ligada al cromosoma X. La mutación se presenta tanto en varones como en mujeres y se estima que la proporción de portadoras para madres de casos esporádicos es aproximadamente del 85%. Asimismo hay que tener en cuenta el riesgo de mosaicismo germinal en las restantes mujeres que no son portadoras constitucionales.

La molécula de Fc VIII está unida, de forma no covalente, a una glicoproteína multimérica llamada Factor von Willebrand (Fc vW) que en el proceso de la hemostasia estabiliza la actividad del Fc VIII y lo trasporta al lugar del tejido dañado. La ausencia o disminución de Fc VIII altera los efectos de la hemostasia.

La severidad clínica de la hemofilia A está directamente relacionada con la concentración de Fc VIII en plasma, y es así que niveles por debajo del 1% están asociados a la forma severa, pacientes con tasas de Fc VIII del 2 al 5% presentan la forma moderada, y aquéllos con tasas del 6 al 20% tienen problemas leves.

Los pacientes con deficiencia severa de Fc VIII, pueden presentar hemorragias espontáneas intraarticulares (hemartrosis), especialmente en rodillas, tobillos, muñecas, codos y caderas, dando como resultado artropatías progresivas si no se trata a los enfermos. A las hemorragias intraarticulares se suman las hemorragias intramusculares y las hemorragias retroperitoneales.

Si bien antes se consideraba una enfermedad letal, la terapéutica sustitutiva (ya sean hemoderivados plasmáticos o concentrados de Fc VIII-C), ha supuesto un gran avance en términos de esperanza y calidad de vida. Sin embargo, dicho tratamiento comportó el riesgo de transmisión de enfermedades (hepatitis y SIDA, entre las más notables) hasta la utilización de los métodos de inactivación viral y concentrados recombinantes de factor VIII-C.

En la actualidad, la aparición de inhibidores contra el Fc VIII-C constituye uno de los mayores problemas terapéuticos. Alrededor del 15% de los casos de hemofilia A producen anticuerpos (actividad inhibidora) a la infusión de Fc VIII.

Históricamente la detección de portadoras se basaba en cálculos bayesianos a partir del pedigree (árbol familiar) y de las tasas de Fc VIII activo, Fc von Willebrand y coFc ristocetina. Este análisis hacía posible predecir el genotipo de un 70% a 95% de las portadoras potenciales. En el pasado, el diagnóstico prenatal dependía de la medida de los factores de la coagulación en plasma fetal, obtenido por fetoscopia, y más recientemente por funículocentesis.

Sin embargo, la identificación del gen del Fc VIII ha facilitado el análisis de ligamiento para detección de portadoras y diagnóstico prenatal.

  • Patologia molecular de la hemofilia A El gen que codifica para el Fc VIII fué clonado y caracterizado en 1984. Se trata de uno de los genes más grandes que se conoce (186 Kb) y se vio que las mutaciones en el mismo son muy heterogéneas. En 1993 fue identificada la mutación más habitual que afecta aproximadamente al 45% de las familias con hemofilia A ù, tratándose de una recombinación homóloga entre secuencias del intrón 22 y otras secuencias en el telómero del cromosoma X.
    Esta recombinación da como resultado la inversión de una parte del extremo 3' del gen y la interrupción de la transcripción. En otras palabras el gen se divide en dos partes y queda orientado opuestamente y separado por unas 500 Kb. Se puede hacer el análisis directo de la mutación para detectar estas inversiones. A los pacientes que no presentan inversión se los estudia para detectar otras mutaciones y con los marcadores de ADN intra y extragénicos. El análisis de ligamiento con estos marcadores permite diagnosticar el estado de portadoras o individuos a riesgo con una alta fiabilidad.
  • Diagnóstico de portadoras y asesoramiento genético Las indicaciones para el análisis son: el diagnóstico de portadoras para mujeres con historia familiar de hemofilia A y el diagnóstico prenatal de hemofilia A. Se realiza los siguientes estudios: Análisis directo de la mutación: Se identifican las inversiones dentro del gen del Fc VIII, mediante técnica de Southern blot, con el uso de la sonda 482.6 y el enzima de restricción Bcl I (actualmente el análisis por PCR detecta inversión pero no discrimina si es distal o proximal). Los pacientes sin inversión se estudian mediante amplificación selectiva de las regiones codificantes del gen del factor VIII, SSCP y secuencicación para detectar otras mutaciones.
  • Análisis de ligamiento: Como no es posible la detección de todas las mutaciones, se utilizan marcadores intragénicos y extragénicos del gen del Fc VIII para el análisis indirecto de la presencia del gen defectuoso. Los marcadores utilizados incluyen dos polimorfismos de restricción intragénicos ( Bcl I/intrón 18 y Xba I/intrón 22), dos microsatélites (CA)n intragénicos (intrón 13 y 22) y dos marcadores extragénicos ( St14 y Dx13 ). La detección de estos polimorfismos se realiza por análisis de Southern blot o por PCR. Para llevar a cabo el estudio se requieren muestras de diversos familiares, incluyendo padres, abuelos y afectados, así como posibles portadoras.

Referencias:

1.Sitio web www.santpau.es

2. (Fedhemo nº27 pags 7-31);

3.Tizzano E., Domènech M., Altisent C., Tusell J., Baiget M: Inversions in the factor VIII gene in Spanish Hemophilia A patients. Blood 83:3826, 1994.

4.Tizzano E., Domènech M., Baiget M. Inversion of the intron 22 in isolated cases of hemophilia A. Thrombosis and Haemostasia 73:6-9 (1995).

5.Antonarakis SE et. al.: Factor VIII inversions in severe hemophilia A: Results of an International Consortium study. Blood, 86:2206-2212, 1995.


Hemofilia B

La hemofilia B es el resultado del déficit o alteración de un factor de coagulación dependiente de la vitamina K: el factor IX (Fc IX). Como en el caso de la hemofilia A, se trata de una enfermedad hereditaria que se transmite ligada al cromosoma X. Su incidencia es menor que la hemofilia A, siendo aproximadamente 1 de cada 30.000 varones nacidos.

La importancia clínico-patológica, social y económica de esta enfermedad puede compararse en muchos aspectos a la hemofilia A. Es así que la edad de las manifestaciones hemorrágicas en los pacientes con hemofilia B está relacionada con los niveles plasmáticos del factor IX. Así, una actividad de factor IX menor del 1%, entre un 2 y un 5% y un 5 a 30% se reflejan, en general, con un curso ù, moderado y leve, respectivamente.

Patología molecular de la hemofilia B El gen del factor IX tiene un tamaño de 34 kb. Con respecto a los mecanismos moleculares responsables de la expresión clínica de hemofilia B, muchas de las consideraciones hechas con hemofilia A son aplicables también a la hemofilia B. Sin embargo, en la hemofilia B no existe una mutación mayoritaria como es el caso de la inversión del intrón 22 de la hemofilia A. En la actualidad se ha demostrado que las mutaciones en el gen del Fc IX son también heterogéneas, lo que hace dificultosa la tarea de identificarlas.

Los marcadores del ADN se pueden emplear para estudiar el patrón de segregación anómalo en las familias con afectados de hemofilia B. Estos marcadores, se sitúan en el interior del gen (intragénicos) o cerca de él, en la región q28 del cromosoma X (extragénicos). En ambos casos se trata de análisis indirecto del gen anómalo. Es posible que en algunas familias exista falta de informatividad de los marcadores del ADN utilizados. La utilización de marcadores intragénicos o adyacentes al gen minimiza la probabilidad de recombinación entre la mutación y el o los polimorfismos estudiados. Esto hace que los resultados sean altamente fiables pero de tipo probabilístico.

Diagnóstico de portadoras y asesoramiento genético Las indicaciones para el análisis genético son: el diagnóstico de portadoras para mujeres con historia familiar de hemofilia B. Y el Diagnóstico prenatal de hemofilia B. Se puede realizar dos tipos de análisis:

  • Análisis directo: Se realiza amplificación selectiva de las regiones codificantes, SSCP y secuenciación para detectar mutaciones y un
  • Análisis de ligamiento o indirecto: Se utilizan marcadores intragénicos y extragénicos del gen del Fc IX para el análisis indirecto de la presencia del gen hemofílico. Los marcadores utilizados incluyen cinco polimorfismos intragénicos: DdeI en el intrón 1; XmnI en intrón 3; TaqI en el intrón 4; HhaI en el extremo 3´ flanqueante. Los casos no informativos se estudian con dos microsatélites flanqueantes extragénicos: 5´ 1192 (DXS102) y 3´ 1205 (DXS105). La detección de estos polimorfismos se realiza por análisis de PCR. Para llevar a cabo el estudio se requieren muestras de diversos familiares, incluyendo padres, abuelos y afectados, así como posibles portadoras.

Referencias:

1. Pag web www.sant-pau.es

2.Peak IR, Lillicrap DP, Boulyjenkov V, Briët E, Chan V, Ginter EK, Kraus EM, Ljung R, Manucci PM, Nicolaides K, Tuddenham GD. Report of a joint WHO/WFH meeting on the control of haemophilia: carrier detection and prenatal diagnosis. Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4:313-344,1993.

3.Gianelli F. y Green P. The molecular basis of haemophilia A and B. Baillière´s Clinical Hematology, 9:211-228, 1996. 4.Montejo JM, Magallón M, Tizzano E, Solera J. Identification of twenty-one new mutations in the factor IX gene by SSCP analysis. Human Mutation 13:160-165, 1999.


Estudios genéticos en hemofilia en el Servicio de Genética del Hospital de la Santa Creu y Sant Pau (Barcelona)

El laboratorio de Genética del Hospital Sant Pau es centro de referencia para el estudio molecular de la hemofilia A y B en nuestro país.

Este grupo ha recibido el premio DUQUESA DE SORIA en su convocatoria 1999-2000 por su trabajo: PATOLOGIA MOLECULAR DEL GEN DEL FACTOR VIII: SU RELACIÓN CON EL DESARROLLO DE INHIBIDORES, SU APLICACIÓN AL ASESORAMIENTO GENÉTICO Y SU IMPORTANCIA PARA LAS NUEVAS ALTERNATIVAS TERAPEUTICAS. (Fedhemo nº27)

El equipo de trabajo de este grupo ha estudiado 305 familias(163 con Hemofilia A familiar y 142 con un caso esporádico), 197 casos de HF grave; 64 moderadas y 44 leves.

La mutación en el factor VIII fue detectada en 133 pacientes, en esas familias se estudio la mutación en las 99 portadoras obligadas y las 282 mujeres a riesgo de ser portadoras para confirmar su presencia o no en las mismas.

En 15 familias no existía afectado disponible y se analizó a las madres de los mismos.

Las familias se dividieron en tres grupos: 58 casos familiares (más de un afectado en dos generaciones), 8 casos de posible mosaicismo (más de un afectado en una generación de hermanos pero sin otros afectados en al familia) y 67 casos esporádicos.

El diagnóstico molecular de todos los casos estudiados tanto directo como indirecto puede resumirse en la tabla: ( Tabla I(Fedhemo nº27 pags 7-31)

El estudio de portadoras, casos familiares y estudio de casos esporádicos se representa en la siguiente tabla (Tabla IV (Fedhemo nº27 pags 7-31)

El diagnóstico prenatal de la hemofilia A. La detección de mutaciones facilitó el diagnóstico prenatal de 38 mujeres portadoras de hemofilia A, algunas de las cuales solicitaron este diagnóstico en más de una ocasión.

En todos los casos los polimorfismos (análisis indirecto) se correlacionaron con el estudio directo. Las conclusiones del trabajo llevado a cabo por este laboratorio nos dan una idea de cómo es la estrategia de estudio molecular de esta enfermedad y sus expectativas reales con mucha fiabilidad dado el gran número de casos estudiados. Conclusiones ( pag 29 Fedhemo nº27 pags 7-31)

Tabla I y Tabla IV


Estudios genéticos en hemofílicos y familiares en el Hospital Donostia

El servicio de INMUNOLOGIA en su sección de Biología molecular (Dra. de Juan) , colabora con el servicio de HEMATOLOGIA (Dra. Maite Uranga), prestando su apoyo técnico para el encauzamiento a la realización del estudio genético de enfermos, portadoras y familiares de Hemofilia A y B, confeccionando los árboles genealógicos familiares y definiendo los casos de portadoras y familiares a estudiar en cada caso, procesando y enviando las muestras para su estudio al servicio de genética del Hospital Sant Pau y como interlocutores en todo el proceso de diagnóstico.

Desde que existe esta colaboración, aproximadamente desde el año 1997 se han estudiado: 12 familias de hemofilia A de las cuales 6 son casos familiares y 6 casos esporádicos; 4 casos pertenecían a casos de hemofilia A grave; 3 a casos moderados y 5 a casos leves. Se estudiaron en total 12 pacientes; 13 portadoras obligadas y 38 portadoras de riesgo.

En 10/12 familias el estudio ha sido informativo, en una de las restantes esta pendiente aún. En el estudio molecular se ha encontrado: una inversión del intrón 22; se han caracterizado 3 mutaciones del gen del factor VIII.

Se ha realizado un diagnóstico de portadora en el embarazo y un diagnóstico prenatal. Por otra parte, se han estudiado 3 familias de Hemofilia B, dos esporádicas y un caso familiar con un total de 4 pacientes; 3 portadoras obligadas y 12 portadoras de riesgo. El estudio ha sido informativo en los 3 casos. Se ha realizado un diagnóstico prenatal.